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酵母双杂全段不结合,分段却会结合,为什么?

来源:百度知道 编辑:从小磊
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酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法, 有多方面的应用, 但仍存在一些局限性。⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等, 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助, 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物, 从而引起报告基因的表达, 产生假阳性结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展,。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少假阳性的发生;发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白间的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势vii:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因, 可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力, 尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统Ⅷ也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中,一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白,另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体(CAT)共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用, 得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速,在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而,哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段。

酵母双杂交法的原理?

答:酵母双杂交法的原理: 典型的真核生物转录因子, 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。 前者可识别DNA上的特异序列, 并使转录激活结构域定位于所...

酵母双杂交可用于报道基因的种类有哪些?产物有哪些

答:酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i .典型的真核生长转录因子, 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain).前者可识别DNA...

酵母双杂交,营养缺陷培养基长出菌落,但提质粒,没有

答:酵母双杂交,营养缺陷培养基长出菌落,但提质粒 发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因,如广泛采...

鲑鱼精dna在做酵母双杂使用时怎么处理

答:注意事项 (1)酵母双杂交对照的设定 常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照,以MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统为例: 阳性对照:pGADT7-T + pGBKT7-53,其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能...

酵母双杂交的基本原理

答:双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明,转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结...

酵母双杂交实验操作步骤大全的信息你有吗?

答:最近在做龙须菜高温胁迫表达cDNA文库的构建,选择的是CaM做诱饵质粒构建表达载体pGBKT-CaM,利用SMART技术将重组质粒转化到酵母菌Y187中,搜集了部分资料找到了一份比较全的酵母双杂交实验操作步骤。 一.酵母双杂交系统的原理 酵母的转录激活因...

酵母双杂交筛怎样相互验证?

答:睿星生物科技酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)已广泛应用于蛋白相互作用的研究、新蛋白筛选和蛋白功能研究等方面,该项技术已经成为任何研究细胞信号传导网络、蛋白结构与功能的实验室必不可少的手段。但由于其技术操作复杂及假阳性结果...

酵母双杂文库筛选出互作蛋白,然后再怎么做

答:酵母双杂文库筛选出互作蛋白之后,可以看一下敲除互作蛋白,对目的蛋白有什么影响。 再寻找一下在互作蛋白的突变型中,目的蛋白有什么变化 而且酵母双杂的假阳性很高,最好在原来的研究的生物系统中再验证一下,比如免疫共沉淀实验在验证以便。...

酵母双杂交筛库不加3-at有什么影响

答:假阳性 非常多,你是 -LWH 3缺+ 3-AT 吗?

酵母双杂连接片段cds需要加终止密码子吗

答:TGA终止密码子针对的是DNA所说,也就是mRNA上的UGA终止密码子


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